兩個(gè)卵子也能繁殖后代雄性難道已多余

近日，兩個(gè)卵子結(jié)合產(chǎn)生后代的研究一經(jīng)發(fā)表，立即引起熱議，很多男性開始擔(dān)心自己的“生殖地位”會(huì)下降。事實(shí)上，男性的半邊天在一連串打擊下飽受壓力：Y染色體的消失、克隆動(dòng)物的出現(xiàn)以及兩個(gè)卵子可產(chǎn)生后代。雄性動(dòng)物會(huì)被“忽略”嗎？

沒有“爸爸”的小雌鼠。供圖：李勁松 文｜葉水送

兩個(gè)卵子的結(jié)合，居然成功產(chǎn)出健康的幼鼠，整個(gè)過程無需雄性參與。這一顛覆了人們對(duì)生殖認(rèn)識(shí)的研究成果，11月17日發(fā)表在科學(xué)期刊Cell Rsearch上，引發(fā)媒體持續(xù)地關(guān)注。

這項(xiàng)研究是上海生化與細(xì)胞研究所研究員李勁松在單倍體細(xì)胞系研究領(lǐng)域的又一次突破。很多人擔(dān)心這一技術(shù)會(huì)使用在人類身上。對(duì)此，李勁松表示，“強(qiáng)烈反對(duì)利用這種技術(shù)來制造人類后代”。

中國科學(xué)院上海生化與細(xì)胞研究所研究員李勁松

- 令人著迷的單倍體細(xì)胞系 -

單倍體細(xì)胞系研究一直讓各國科學(xué)家著迷。這是因?yàn)橥ㄟ^單倍體細(xì)胞克隆的個(gè)體是研究者研究生命奧秘的理想模型，研究者可針對(duì)單倍體細(xì)胞進(jìn)行基因編輯。由此產(chǎn)生的表型直接體現(xiàn)在幼鼠身上，極大地提高了基因編輯的效率。

李勁松對(duì)這一領(lǐng)域的興趣并非一時(shí)興起，當(dāng)年還在洛克菲勒大學(xué)做博后的他，面臨著抉擇：回國后是繼續(xù)他博后進(jìn)行的嗅覺神經(jīng)方面研究，還是從事他從本科到博士一直進(jìn)行的干細(xì)胞研究。經(jīng)歷一番掙扎后，李勁松繼續(xù)他所熱愛的胚胎發(fā)育與細(xì)胞重編程研究。

對(duì)于很多低等生物來說，如酵母、蕨類植物等，它們可以以單倍體的形式存活。但對(duì)于高等生物來說，單倍體只存在其成熟后形成的配子中，如精子和卵子。從嚴(yán)格意義上來講，卵子也是雙倍體，因?yàn)樗挥性谑芫?，才?huì)將第二極體排出形成單倍體。單倍體細(xì)胞只有一套染色體，降低了基因組的復(fù)雜程度，在遺傳分析、基因功能與性狀研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，因而單倍體細(xì)胞是生命科學(xué)研究的窗口以及重要工具。然而如何獲得高等動(dòng)物的單倍體細(xì)胞系研究，一直困擾著這一領(lǐng)域的各國科學(xué)家。

2012年，李勁松和徐國良合作通過將精子注入去核的卵母細(xì)胞中建立小鼠的類精子單倍體細(xì)胞系，成功與小鼠的卵細(xì)胞結(jié)合，產(chǎn)生具有穩(wěn)定遺傳性狀的幼鼠。這項(xiàng)具有突破性的研究發(fā)表在Cell雜志上。

“2012年發(fā)表這項(xiàng)研究時(shí)，Cell雜志的編輯也認(rèn)為，建立一個(gè)可培養(yǎng)的類精子單倍體細(xì)胞系，從概念到技術(shù)都很新穎?！崩顒潘杀硎尽?/p>

事實(shí)上，無論是人類還是小鼠，從精原干細(xì)胞到最后在附睪加工成成熟的精子這一過程非常復(fù)雜，精子一旦成熟，結(jié)構(gòu)功能特化，而且不會(huì)再分化，如果在體外能建立一個(gè)類精子單倍體細(xì)胞系，并且能代替精子與卵子結(jié)合形成受精卵，意義會(huì)很大。

同年，中科院動(dòng)物研究所研究員周琪、趙小陽也利用小鼠的精子與去核的卵細(xì)胞結(jié)合形成孤雄單倍體細(xì)胞，再與卵細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合，產(chǎn)生出健康的小鼠。該研究發(fā)表在Nature雜志上。

盡管半克隆小鼠的研究結(jié)果令人振奮，但是如何將這項(xiàng)技術(shù)從概念向工具轉(zhuǎn)化仍有阻力。研究者發(fā)現(xiàn)半克隆小鼠出生效率很低，僅為4.5%，且將近一半的幼鼠出現(xiàn)發(fā)育不良的現(xiàn)象。

2013年一整年，李勁松實(shí)驗(yàn)室一直在尋找解決這個(gè)問題的關(guān)鍵。最終他們發(fā)現(xiàn)，雄性印記基因H19在半克隆小鼠中高表達(dá)，是導(dǎo)致小鼠出生率低、發(fā)育遲緩的關(guān)鍵因素。當(dāng)研究者修復(fù)基因H19的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)半克隆小鼠的出生率顯著提高，但是發(fā)育失敗率仍然很高。后來發(fā)現(xiàn)另一雄性印記基因Gtl2同樣過表達(dá)，于是研究者再將這個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行修復(fù)，結(jié)果小鼠的出生率達(dá)到了20%。這一結(jié)果顯示，兩個(gè)雄性印記基因的過表達(dá)，導(dǎo)致小鼠發(fā)育率低以及發(fā)育異常。

至于半克隆小鼠為何全都是雌鼠，李勁松表示，精子分為兩種，或攜帶X染色體，或攜帶Y染色體，它們進(jìn)入卵子后分別產(chǎn)生雌性和雄性個(gè)體。但是，所有的單倍體干細(xì)胞，不管是精子來源，還是卵子來源，全部都是攜帶X染色體的，所以利用單倍體干細(xì)胞產(chǎn)生的半克隆小鼠均是雌性。

李勁松進(jìn)一步解釋，X染色體上有上千個(gè)基因，對(duì)細(xì)胞的生存有著至關(guān)重要的作用，細(xì)胞如果沒有X染色體是不能存活的，因此不可能從Y染色體的精子中產(chǎn)生單倍體細(xì)胞系，后代自然不會(huì)出現(xiàn)半克隆的雄性個(gè)體。目前的研究發(fā)現(xiàn)，這些半克隆小鼠能夠健康長(zhǎng)大成年并具有生育能力，至于這些小鼠未來是否存在其它方面的健康隱患，目前還不得而知。

- 當(dāng)半克隆技術(shù)遇到CRISPR/Cas9 -

2013年，李勁松課題組的一篇文章顯示，通過直接向攜帶白內(nèi)障遺傳缺陷的小鼠受精卵中注入CRISPR/Cas9系統(tǒng)后，即可編輯受精卵的基因達(dá)到修復(fù)遺傳缺陷的目的。但是，當(dāng)時(shí)的修復(fù)效率只有30%，且經(jīng)過基因編輯的受精卵存在少量的脫靶。

為了解決這兩個(gè)問題，2014年，李勁松課題組與北京大學(xué)湯富酬實(shí)驗(yàn)室和上海生化與細(xì)胞研究所吳立剛實(shí)驗(yàn)室合作，利用CRISPR/Cas9在白內(nèi)障小鼠精原干細(xì)胞中進(jìn)行遺傳修復(fù)并建立一系列的精原干細(xì)胞系，通過嚴(yán)格分析，選擇修復(fù)的并且不攜帶任何脫靶的精原干細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植，用于產(chǎn)生健康的雄性配子，從而實(shí)現(xiàn)后代100%不攜帶白內(nèi)障遺傳缺陷。隨著半克隆技術(shù)和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的日趨成熟，通過兩種技術(shù)的結(jié)合進(jìn)行小鼠疾病模型建立或者遺傳疾病的治療研究變得更簡(jiǎn)單。

李勁松認(rèn)為，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)改造生殖細(xì)胞主要有兩個(gè)策略，一是編輯受精卵，二是編輯生殖單倍體細(xì)胞（配子），編輯生殖單倍體細(xì)胞更具前景，因?yàn)樗茉谂渥咏Y(jié)合成受精卵之前進(jìn)行篩查，從而保障配子的基因改造準(zhǔn)確性大大提高，減少CRISPR/Cas9技術(shù)由于脫靶帶來的弊端。正由于CRISPR/Cas9技術(shù)目前還存在脫靶問題，因此他反對(duì)目前將該技術(shù)使用在人類生殖細(xì)胞基因修飾上?！斑@會(huì)存在很大的風(fēng)險(xiǎn)”，李勁松表示。

- 雄性會(huì)逐漸被“忽略”嗎? -

兩個(gè)卵子結(jié)合產(chǎn)生后代的研究一經(jīng)發(fā)表，立即引起人們的熱議，很多男性開始擔(dān)心自己的地位會(huì)下降。事實(shí)上，男性的半邊天在一連串打擊下飽受壓力：Y染色體的消失、克隆動(dòng)物的出現(xiàn)以及兩個(gè)卵子可產(chǎn)生后代。雄性動(dòng)物真的會(huì)被“忽略”嗎？

1600萬年前，X、Y染色體同時(shí)出現(xiàn)，擁有相同的長(zhǎng)度，但隨后Y染色體不斷縮短，截至目前其僅為X染色體長(zhǎng)度的1/3。澳大利亞拉籌伯大學(xué)（La Trobe University）研究員詹妮弗·格拉芙（Jennifer Graves）甚至給出Y染色體450萬年后很有可能會(huì)消失的論斷，雄性動(dòng)物的地位似乎岌岌可危。

自然法則似乎也印證了格拉芙這一令人不安的結(jié)論：一種生活在日本的田鼠，在進(jìn)化過程中竟將自己的Y染色體弄丟，好在它們?cè)诩?xì)胞的常染色體上重新找到新的性別決定基因，如果不是這樣，那么它們只會(huì)落入進(jìn)化終結(jié)的死胡同里，繼而滅絕，從這個(gè)星球上消失。它們的現(xiàn)在或許是人類的未來嗎？

正如我們所知，很多動(dòng)物的繁殖需要精卵結(jié)合才可孕育下一代，但對(duì)于低等生物個(gè)體而言，它們采取無性生殖，即可大量繁衍后代，從而迅速建立種群優(yōu)勢(shì)。稍微高等的一些動(dòng)物，它們會(huì)采取無性和有性生殖結(jié)合的繁殖策略，當(dāng)食物豐盛、氣候適宜時(shí)，它們會(huì)把精力放在快速增殖上，采取無性生殖策略，當(dāng)天氣開始變冷，環(huán)境惡劣時(shí)，雌性個(gè)體通常會(huì)尋覓雄性個(gè)體進(jìn)行有性生殖，從而產(chǎn)生健壯的后代以度過艱難時(shí)刻。脊椎動(dòng)物營(yíng)有性生殖，繁殖下一代需兩性結(jié)合。

自從克隆動(dòng)物出現(xiàn)后，這一規(guī)則受到嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。1996年，英國愛丁堡大學(xué)科學(xué)家伊恩·維爾穆特（Ian Wilmut）利用細(xì)胞核移植技術(shù)，在全球首次克隆出大型哺乳動(dòng)物——克隆羊“多莉”，“多莉”沒有父親，它是維爾穆特利用一只羊的乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核與另外一只羊的去核卵細(xì)胞結(jié)合誕生的，它是人類第一次真正意義上利用“無性生殖”的方式產(chǎn)生出的哺乳動(dòng)物，隨后貓、狗、豬、牛等動(dòng)物相繼被克隆出來。

顛覆人們對(duì)生殖的認(rèn)識(shí)的科學(xué)研究似乎沒有停止的意思。李勁松研究組這項(xiàng)發(fā)表在Cell Research雜志上的研究顯示：兩個(gè)卵子也能產(chǎn)生出健康的后代。研究人員通過在卵子中建立攜帶基因修飾的單倍體細(xì)胞系，然后再將這些細(xì)胞與另一只雌鼠的卵細(xì)胞結(jié)合，之后可高效地產(chǎn)生出健康的小鼠出來。

至于兩個(gè)精子是否產(chǎn)生后代，李勁松在接受媒體采訪時(shí)如是回答，“精子比卵子小得多、簡(jiǎn)單得多。卵子有可能被改變成精子，但反過來就會(huì)困難得多?！?/p>

- 單倍體細(xì)胞系的未來應(yīng)用 -

事實(shí)上，科學(xué)家持續(xù)開展的單倍體細(xì)胞系的研究對(duì)生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究、人類疾病研究的意義遠(yuǎn)大于人們對(duì)于雄性個(gè)體地位可能被“忽略”的擔(dān)憂。

2015年上半年，李勁松實(shí)驗(yàn)組成功建立了“類精子細(xì)胞”的單倍體細(xì)胞系，它們能穩(wěn)定地與雌鼠的卵細(xì)胞結(jié)合，產(chǎn)生出半克隆小鼠。由于小鼠研究在人類健康以及癌癥等方面具有很大的參考價(jià)值，這些具有穩(wěn)定遺傳的“類精子細(xì)胞”的單倍體細(xì)胞系自然意義非凡。

單倍體細(xì)胞系的建立，未來有望作為一個(gè)工具來使用，研究者可進(jìn)行多基因的敲除或者敲入實(shí)驗(yàn)。例如，研究者對(duì)三個(gè)基因的同時(shí)表達(dá)感興趣，可以通過把這些基因敲入單倍體干細(xì)胞中，然后通過卵子注射獲得攜帶三基因同時(shí)敲入的半克隆小鼠。

事實(shí)上，人類的疾病大多數(shù)也是由多基因突變或缺失引起，如果將這些突變基因敲入到單倍體細(xì)胞體系中，那么人們就能很好地建立人類疾病的小鼠模型，通過對(duì)小鼠的表型研究，有助于人們了解這類疾病的發(fā)生以及發(fā)展。以往科學(xué)家都是基于細(xì)胞水平研究人類多基因介導(dǎo)的疾病，很難做到個(gè)體水平的研究，現(xiàn)在已經(jīng)可以通過哺乳動(dòng)物的個(gè)體模型來研究人類的疾病特征。

在采訪結(jié)束時(shí)，李勁松表示，下一步的主要工作是在靈長(zhǎng)類動(dòng)物身上建立能代替精子使用的單倍體細(xì)胞系，從而可以通過注入卵子獲得半克隆猴子，進(jìn)而更好地研究人類的疾病。